【儲存條件及有效期】

1. 儲存條件：溫度 ≤ -20 °C恒溫環(huán)境，避光保存，避免重壓；

2. 產(chǎn)品有效期：14個月；

3. 生產(chǎn)日期見外包裝。

【適用儀器】

1. 適用于Applied Biosystems 7500、

QuantStudio 3/5、QuantStudio 6/7 Flex等熒光定量PCR儀；

1. 適用于我司的WL-16-III等恒溫?zé)晒鈾z測儀。

【樣本要求】

1. 按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)采集樣本；

2. 樣本采集后建議盡快檢測，24小時內(nèi)進行檢測樣本可暫時保存于4 ºC；長時間保存則置于-70℃以下，并避免反復(fù)凍融；

3. 如使用樣本保存液或快速釋放劑等處理樣本，注意影響蛋白活性的物質(zhì)如酸、堿、鹽、表面活性劑等殘留對試劑性能的影響。

【檢測方法】

1.試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

1.1取出包裝盒中的各組分(凍干試劑除外)，室溫放置，融化后混勻，瞬時離心備用（注意，如未完全融化直接使用可能對實驗效果產(chǎn)生影響）；

1.2根據(jù)待測樣本、陰性和陽性對照的數(shù)量準(zhǔn)備凍干試劑，每個凍干試劑加入37.5 μL E buffer。

2.樣本處理（樣本處理區(qū)）

2.1核酸提取

選擇合適的核酸提取方法和試劑提取樣本核酸；

2.2向反應(yīng)管中加入10 μL核酸模板（模板量可調(diào)整，以無菌水補足；即核酸模板加無菌水共10 μL），陽性對照加入10 μL正對照模板，陰性對照加入10 μL無菌水；

2.3每個反應(yīng)管加入2.5 μL B buffer, 蓋好管蓋（對于多個反應(yīng)，建議將B buffer加至反應(yīng)管的蓋子內(nèi)側(cè)）；上下顛倒反應(yīng)管8-10次充分混合，混勻后，將反應(yīng)液甩（或快速離心）至管子底部，轉(zhuǎn)移至擴增區(qū)。

3.核酸擴增（擴增區(qū)）

根據(jù)不同的應(yīng)用需求可以選擇不同的程序設(shè)置方式：

1. 程序設(shè)置方案一（推薦）：靈敏度高，適用于低濃度樣本檢測，但擴增曲線可能出現(xiàn)非典型S形態(tài)，不同濃度樣本結(jié)果Ct無明顯規(guī)律；

程序設(shè)置方案一結(jié)果示例

2.  程序設(shè)置方案二：操作簡便，低拷貝樣本檢出率低于程序設(shè)置方案一。

注：

i 溫度設(shè)置推薦39℃；

ii. 步驟①為孵育階段，在恒溫金屬浴進行；孵育結(jié)束后上下顛倒反應(yīng)管8-10次充分混勻后瞬離，再進入步驟②；

iii. 步驟②為熒光檢測階段，檢測通道為FAM，30s/cycle，30個循環(huán)，時長15分鐘；

iiii.使用ABI系列熒光定量PCR儀，請務(wù)必于Passive Reference和Quencher處均選擇“None”。

3.1.2 質(zhì)量控制

陰性對照Ct值 ≥27或未檢出，陽性對照Ct值 ≤ 15；同一實驗需同時滿足以上要求，否則本次實驗視為無效。

3.1.3 結(jié)果判讀

根據(jù)分析后熒光曲線圖像調(diào)整檢測通道的基線（Baseline）和閾值（Threshold），基線起始設(shè)為1~2循環(huán)、終止設(shè)在本組數(shù)據(jù)中最小的CT值循環(huán)處（一般可設(shè)置為2~4），使各項參數(shù)符合“3.1.2質(zhì)量控制”中的要求，然后進行陰陽性判定：FAM通道擴增曲線呈指數(shù)增長且Ct<27為陽性；FAM通道擴增曲線無Ct值或Ct≥27為陰性。

3.2程序設(shè)置方案二

3.2.1 程序設(shè)置

39℃，FAM通道30秒采集一次熒光信號，設(shè)置40個循環(huán)。

3.2.2質(zhì)量控制

陰性對照Ct值≥35或未檢出；陽性對照Ct值≤ 20；同一實驗需同時滿足以上要求，否則本次實驗視為無效。

3.2.3結(jié)果判讀

根據(jù)分析后熒光曲線圖像調(diào)整檢測通道的基線（Baseline）和閾值（Threshold），基線起始設(shè)為1~2循環(huán)、終止設(shè)在本組數(shù)據(jù)中最小的CT值循環(huán)處（一般可設(shè)置為2~6），使各項參數(shù)符合“3.2.2質(zhì)量控制”中的要求，然后進行陰陽性判定：FAM通道擴增曲線呈指數(shù)增長且Ct<35為陽性；FAM通道擴增曲線無Ct值或Ct≥35為陰性。

【檢驗結(jié)果的解釋】

1. 樣本采集、運輸、保存不當(dāng)，試劑運輸、保存、配制不當(dāng)都可能會影響實驗結(jié)果，甚至?xí)��?dǎo)致假陰性結(jié)果；

2. 如果實驗室污染、試劑污染、樣品交叉污染，可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3. 因方法學(xué)差異，使用市面上部分品牌的熒光PCR儀可能出現(xiàn)熒光曲線異�，F(xiàn)象，推薦使用我司設(shè)備或Applied Biosystems系列熒光定量PCR儀。

【注意事項】

1. 使用前請仔細(xì)閱讀說明書，嚴(yán)格按照操作步驟進行操作；

2. 樣品處理應(yīng)該嚴(yán)格按照生物安全規(guī)范操作，實驗過程中應(yīng)穿著工作服，戴一次性手套，實驗分區(qū)域進行避免交叉污染；

3. 使用有效期內(nèi)試劑，且各組分不得與其他批號混用，試劑盒各組分使用前室溫充分融化后混勻，短暫離心后使用；

4. 反應(yīng)管中盡量避免氣泡存在，管蓋蓋緊，反應(yīng)結(jié)束后擴增管置于密封袋內(nèi)，按要求丟棄處理；

5. 本試劑盒僅用于科研使用，不作為臨床診斷使用。