草蝦是我國(guó)淡水養(yǎng)殖業(yè)中的一種重要經(jīng)濟(jì)物種，但近年來(lái)，寄生于其肝胰腺的肝腸胞蟲嚴(yán)重影響了其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)。由于目前沒(méi)有有效的藥物或疫苗可以治療該病，快速而精準(zhǔn)的檢測(cè)對(duì)于防止病害傳播至關(guān)重要。

EHP孢子掃描電鏡觀察結(jié)果A.放大9.0×10³倍; B.放大5.0×10⁴倍.

喬毅, 沈輝, 萬(wàn)夕和, 范賢平, 蔣葛, 黎慧, 王李寶, 史文軍, 成婕. 南美白對(duì)蝦肝腸胞蟲的分離及形態(tài)學(xué)觀察. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2018, 25(5): 1051-1058. DOI: 10.3724/SP.J.1118.2018.17430.

肝腸胞蟲的檢測(cè)主要依賴于分子生物學(xué)方法，其中最常見的是PCR技術(shù)。然而，PCR技術(shù)雖然靈敏度高，但需要昂貴的PCR儀器和專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，且操作復(fù)雜，不適合現(xiàn)場(chǎng)使用。為了解決這一問(wèn)題，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了兩種基于MIRA技術(shù)的快速檢測(cè)方法，這些方法具有高靈敏度、快速反應(yīng)和易操作的特點(diǎn)，能夠在現(xiàn)場(chǎng)不需要復(fù)雜實(shí)驗(yàn)設(shè)備的情況下，對(duì)蝦體中的肝腸胞蟲進(jìn)行高效、快速的檢測(cè)，填補(bǔ)了現(xiàn)有檢測(cè)方法不足的空缺。

文章所用的擴(kuò)增試劑：DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（基礎(chǔ)型）與DNA 恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（膠體金試紙條型）

MIRA技術(shù)是一種多酶恒溫快速核酸擴(kuò)增技術(shù)。其核心原理是通過(guò)多種功能蛋白在常溫下協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)核酸的快速擴(kuò)增，是能夠真正實(shí)現(xiàn)便攜式的現(xiàn)場(chǎng)快速核酸檢測(cè)的技術(shù)。

研究方法

樣本提取

研究團(tuán)隊(duì)從遼寧省的三個(gè)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)收集了感染和健康的草蝦樣本，并提取了草蝦的肝胰腺DNA。

引物設(shè)計(jì)

針對(duì)肝腸胞蟲的S8絲氨酸蛋白基因（基因庫(kù)登錄號(hào)：ON 182063），設(shè)計(jì)了三對(duì)MIRA引物。該基因具有獨(dú)特的活性位點(diǎn)，能夠保證檢測(cè)的特異性。

MIRA-AGE與MIRA-LFD檢測(cè)

(A) 優(yōu)化RPA-AGE反應(yīng)溫度。M：DL 500標(biāo)記物；N：陰性對(duì)照；分別為品系1-5：25°C、30°C、37°C、39°C和42°C。

(B) 優(yōu)化RPA-AGE反應(yīng)時(shí)間。M：DL 500標(biāo)記物；N：陰性對(duì)照；1：10 min；2：20 min；3： 30 min；4： 40 min。

(C) 優(yōu)化RPA-LFD反應(yīng)溫度。N：陰性對(duì)照；1：25°C；2：30°C；3：37°C；4：39°C；5：42°C。

(D) 優(yōu)化RPA-LFD反應(yīng)時(shí)間。N：陰性對(duì)照；1：5 min；2：10 min；3：20 min。

兩種MIRA檢測(cè)方法分別通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳（MIRA-AGE）和膠體金側(cè)流免疫層析法（MIRA-LFD）實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了反應(yīng)溫度和時(shí)間。MIRA-AGE在37°C下進(jìn)行30分鐘擴(kuò)增，而MIRA-LFD則在37°C下僅需10分鐘即可完成擴(kuò)增，5分鐘內(nèi)即可讀取結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

特異性與靈敏度

(A) RPA-AGE檢測(cè)的特異性。M：DL 1000標(biāo)記物；P：蒿型腸孢菌；1：肝減少腸細(xì)胞；2：肝孢菌；3：微孢子蟲；4：白斑綜合征病毒；6：異常威克漢姆酵母；N：陰性對(duì)照。

(B) RPA-LFD檢測(cè)的特異性。P：蒿型腸孢菌；N：陰性對(duì)照；1：肝減少腸細(xì)胞；2：肝孢菌；3：微孢子蟲；4：白斑綜合征病毒；6：異常威克漢姆酵母。

(C) RPA-AGE對(duì)重組質(zhì)粒梯度稀釋的敏感性。M： DL 500標(biāo)記；N：陰性對(duì)照；1： 4.7×10^5拷貝/µL；2： 4.7×10^4拷貝/µL；3： 4.7×10^3拷貝/µL；4： 4.7×10^2拷貝/µL；5： 4.7×10拷貝/µL；6： 4.7拷貝/µL。

(D)  RPA-LFD對(duì)重組質(zhì)粒梯度稀釋的敏感性。N：陰性對(duì)照；1： 4.7×10^5拷貝/µL；2： 4.7×10^4拷貝/µL；3： 4.7×10^3拷貝/µL；4： 4.7×10^2拷貝/µL；5： 4.7×10拷貝/µL；和6： 4.7拷貝/µL。

實(shí)驗(yàn)顯示，MIRA技術(shù)具有高度特異性，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出肝腸胞蟲，而對(duì)其他病原體無(wú)反應(yīng)。靈敏度方面，兩種方法的檢測(cè)下限均為4.7copies/µL，顯著高于傳統(tǒng)PCR檢測(cè)的靈敏度。

臨床樣本檢測(cè)

對(duì)30個(gè)臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示，MIRA-AGE與MIRA-LFD的陽(yáng)性率均為70%，略低于qPCR80%的陽(yáng)性率，但遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)PCR的56.7%的陽(yáng)性率。

應(yīng)用前景

基于MIRA的檢測(cè)方法能夠在恒溫下快速擴(kuò)增目標(biāo)基因，特別是MIRA-LFD方法在短短10分鐘內(nèi)即可得到結(jié)果，無(wú)需復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，非常適合在養(yǎng)殖場(chǎng)等現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境中使用。該技術(shù)的高靈敏度和高特異性使其成為一種高效的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)工具，有助于養(yǎng)殖者在早期發(fā)現(xiàn)和控制肝腸胞蟲的傳播，從而保護(hù)草蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。